活性氧檢測試劑盒Reactive oxygen species assay kit
規格：100-500T
產品簡介：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產物過氧化物和羥化物(O2•
−
,
H2O2, •OH, ONOO
−
, •NO)等，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。采用
2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用、靈敏的細胞內活性氧檢探針。DCFH-DA沒有熒光，
進入細胞后被酯酶水解為dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在時DCFH被氧化為不能透過細胞膜的強綠色
熒光物質dichlorofluorescein (DCF)，其熒光在激發波長502 nm，發射波長530 nm附近有大波峰，強度與細
胞內活性氧水平成正比。此活性氧檢測系統本底低，靈敏度高，重復性好，操作簡便。
本試劑盒適于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等圖像檢測，和微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate
reader)、流式細胞儀定量ROS檢測。
工作波長：
佳激發波長500、485 (500 ±15 nm)，佳發射波長525 (530 ±20 nm)。也可按照FITC熒光檢測條件
檢測。
活性氧檢測試劑盒操作步驟：
一、試劑準備：
1. DCFH-DA可稀釋于培養基或緩沖液中。血清或培養基顏色并不影響DCFH-DA及細胞內熒光產生，但
可能會影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀熒光測定。可將DCFH-DA稀
釋于無酚紅培養基或適宜的緩沖液如PBS中。這依賴于使用何種熒光設備進行測定。
2. 加入DCFH-DA的時機或孵育時間，以終能順利檢測細胞內活性氧為目的。藥物處理時間較短(<2
小時)或預計ROS效應較弱，可先加或同時加入DCFH-DA。反之，treat 刺激時間較長(>6 小時)或預計產生
ROS效應較強，可后加DCFH-DA。
3. 活性氧供體含高純度12 mM H2O2。加入細胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過程中可產生其
它類型的活性氧，均可使DCFH-DA氧化為DCF呈現強綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測試實驗系
統或儀器的陽性試劑，以初步觀察細胞活性氧所產生的熒光的一般特征，并且也可以將該實際作為實驗的一
個陽性對照。推薦該試劑的細胞工作濃度為20~100 µM或更低濃度，但超過200µM將產生細胞毒。如果用
戶熟悉ROS熒光或實驗沒有必要采用陽性對照，可以不加該試劑。
二、加入熒光探針：
1. 加入DCFH-DA于培養基，推薦初始工作濃度為10 µM。對不同的細胞和處理，DCFH-DA工作濃度
可為100 nM~20 µM，需進行預實驗確定合適的濃度。總體稀釋倍數應在1:500~1000以上以避免DMSO對細
胞的影響。以DMSO作為溶劑對照。
2. 37 ºC 孵育細胞30min~幾個小時，通常30-60min 即可。孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、
DCFH-DA濃度有關。
3. PBS洗滌細胞2次。
三、活性氧檢測試劑盒熒光檢測
采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡圖像檢測照相，綠色熒光強度代表活性氧水平。也可進行微板熒光
分析儀(multiwell fluorescence plate reader)實時或每10分鐘分時逐點檢測熒光強弱。對于流式細胞儀可將細胞
用胰酶消化PBS洗滌后重懸檢測。