名稱：活性氧檢測試劑盒

貨號：CA1410
規(guī)格：100-500T
產(chǎn)品內(nèi)容：
A 液 DCFH-DA（10 mM） 0.1 ml −20 ºC 保存
B 液 活性氧陽性對照（Rosup, 50mg/mL ） 1 ml −20 ºC 保存
說明書 1 份
產(chǎn)品簡介：
活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種利用熒光探針 DCFH-DA 進行活性氧檢測
的試劑盒。DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成
DCFH。而 DCFH 不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的
DCFH 生成有熒光的DCF 。檢測DCF 的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。
本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測。Rosup 是一種混合物，濃度為
50mg/mL 。
活性氧檢測試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。
本試劑盒可以測定100～500 個樣品。
操作步驟：
一、裝載探針：
對于刺激時間較短（通常為2 小時以內(nèi)）的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥
物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長（通常為6 小時以上）的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥
物刺激細胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細胞。按照1 ∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃
度為10μ mol/L。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，
通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA 不少于1mL 。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 分鐘。用無血清
細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20～30
分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細胞后裝載探針：按照1 ∶1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。細胞收集
后懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中，細胞濃度為一百萬二千萬/mL ，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 分鐘。每隔3 ～
5 分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞
內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞。
通常活性氧陽性對照在刺激細胞20～30 分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup 作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。
二、檢測：
Solarbio
Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd

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Http://www.solarbio。。ｃｎ
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶
標儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀
檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
三、參數(shù)設(shè)置
使用488nm 激發(fā)波長，525nm 發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF 的熒光光譜
和FITC 非常相似，可以用FITC 的參數(shù)設(shè)置檢測DCF 。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。
其它說明：
陽性對照可以按照1 ∶1000 的比例使用。例如裝載好探針的細胞共1mL ，可以加入1 μ L的陽性對照
刺激。通常刺激后20～30 分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照
的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當提高活性氧陽性對照的
濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當降低活性氧陽性對照的濃度。
另外，對于某些細胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1 ∶2000～1 ∶5000
稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA 的濃度為2～5μmol/L。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15～60
分鐘內(nèi)適當進行調(diào)整。
活性氧陽性對照（Rosup）僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。
保存條件：
-20 ℃避光保存，有效期一年。
注意事項：
1. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。
2. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認探針的裝載情況
是否良好。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上圖。
3. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。