酵母基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)
本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，提取酵母基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司*新型材料，能夠高效專(zhuān)一吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。提取的基因組DNA段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。使用本試劑盒提取的基因組DNA可用于各種常規(guī)操作，包括酶切、 PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)。
操作步驟:
使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。 所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
1、取酵母細(xì)胞(不超過(guò)5×107 ce l1 s)，12000rpm離心1min.，盡量吸除上清。
2、酵母細(xì)胞壁的破除：向酵母菌體中加入470ul山梨醇Buffer。充分懸浮菌休，加入25ul酵母破壁酶和5ul β-巰基乙醇，充分混勻。30℃處理1-2h.，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。
3、12000rpm離心lmin，棄上清，收集沉淀。
4、向沉淀中加入200ul溶液A，充分懸浮沉淀，向懸浮液中加入20ul (10mg/ml)的RNase A，充分顛倒混勻，室溫放置10min。
5、加入20ul(10mg/ml)的蛋白酶K，充分顛倒混勻。65℃水浴消化15-30min，消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，直樣品消化*為止。
6、加入200ul溶液B，再加入200ul無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，室溫放置2min。
7、12000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否己加入無(wú)水乙醇)。12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
9、向吸附柱中加入500ul漂洗液， 12000rpm離心l min， 棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
10、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。
11、將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心l min。
12、離心所得洗脫液再加入吸附柱中，12000rpm離心2 min，即可得到高質(zhì)量的基因組DNA。
注意事項(xiàng):
1、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致提取的DNA段較小且提取量下降。
2、若試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。
3、如果實(shí)驗(yàn)中的離心步驟出現(xiàn)柱子堵塞的情況，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。
4、洗脫緩沖液的體積好不少于50ul，體積過(guò)小會(huì)影響回收效率；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)， pH值低于7. 0會(huì)降低洗脫效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。
5、 DNA濃度及純度檢測(cè)：得到的基因組DNA段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。 回收得到的DNA段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1.0相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA、40μg/ml單鏈DNA。OD260/0D280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。
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