線粒體檸檬酸含量測試定試劑盒 微量法

測定意義：CA是線粒體三羧酸循環的*個中間產物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環強度的主要指標之一。

測定原理：CA在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進一步與苯肼反應，生成相應的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰，該波長下吸光度的變化程度可反映出CA的含量。

需要的儀器，耗材:可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽、蒸餾水。 

          線粒體檸檬酸含量測試定試劑盒 微量法

試劑組成和配制：酸性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。堿性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 2mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存；標準液：液體 1mL×1 支，10μmol/mL 檸檬酸標準液，4℃保存。

線粒體中檸檬酸提取：稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本），加入 0.5mL 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃ 離心 5min；取上清另一 EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μL 該上清液和 300μL 堿性提取液中和后可用于細胞質 CA 含量測定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加入 0.5mL 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），取此溶液 300μL 和 300μL 堿性提取液中和，混勻，置冰上待測（不可用于蛋白質含量測定）。測定步驟： 1、分光光度計或酶標儀預熱 30 min 以上，調節波長到 330nm，蒸餾水調零。 2、試劑一、二和三 37℃預熱 10min。 3、樣本測定：空白管和標準管只需要各做一個。試劑名稱(μL) 空白管 標準管 測定管試劑一 60 60 60 蒸餾水 60 標準液 60 樣本 60 試劑二 20 20 20 試劑三 60 60 60 充分混勻，330nm 立即測定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1。檸檬酸含量計算：（1）按蛋白濃度計算檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標準管×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)÷Cpr 蛋白質含量需要另外測定。（2）按樣本鮮重計算檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標準管×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標準管－ΔA空白管) ×V 樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)÷W C 標準管：標準液濃度，10μmol/mL； V 樣：加入反應體系中樣本體積：0.06mL；V 樣總：加入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。注意：檢測限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重。

 相關文獻：

《Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis》 作者:Meixi Peng, Dan Yang, Yixuan Hou, Shuiqing Liu, Maojia Zhao, Yilu Qin, Rui Chen, Yong Teng & Manran Liu 期刊:Cell Death and Disease 影響因子:5.959 PMID:30850587