還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)試（微量法）說(shuō)明書(shū)

微量法
貨號(hào)：BC1175
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑一：液體1 瓶，100mL，4℃保存。
試劑二：液體1 瓶，20 mL，4℃保存。
試劑三：液體1 瓶，8 mL，4℃避光保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑1 支，10mg，4℃避光保存。
還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)試（微量法）產(chǎn)品說(shuō)明：
谷胱甘肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）組成的天然三肽，是一種含
巰基（—SH）的化合物，廣泛存在于動(dòng)物組織、植物組織、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-
二硫代-雙-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5-巰基苯
甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巰基苯甲酸為黃色產(chǎn)物，在波長(zhǎng)412nm 處具有
光吸收。
自備儀器和用品：
分析天平、微量勻漿器（規(guī)格2ml）、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、可見(jiàn)分光光度計(jì)或酶標(biāo)
儀、超微量比色皿或96 孔板。
樣品的處理
1、組織處理：
新鮮組織先用PBS 沖洗2 次，然后稱取動(dòng)物組織或者植物組織0.1g。加入用試劑一潤(rùn)洗過(guò)
的勻漿器中（勻漿器提前放冰上預(yù)冷）；然后加入1ml 試劑一（組織/試劑一比例保持不變即可），
迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000rpm 4℃離心10min；取上清液放置于4℃待測(cè)，
若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（可保存10 天）。
2、血液處理
血漿：將收集的抗凝血于4℃，600g 離心10 分鐘，吸取上層血漿到另一支試管中，加入等體
積的試劑一，4℃，8000g 離心10 分鐘，將上清移入新的試管中放置于4℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成
測(cè)試可放于-80℃保存（可保存10 天）。
血細(xì)胞：將收集的抗凝血于4℃，600g 離心10 分鐘，棄去上層血漿用3 倍體積的PBS 清洗3
次（用PBS 重懸血細(xì)胞，600g 離心10 分鐘），加入等體積試劑一，混勻后4℃放置10 分鐘，8000g
離心10 分鐘，吸取上清放于4℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（可保存10 天）。
3、細(xì)胞處理
收集不少于106 個(gè)細(xì)胞，先用PBS 清洗細(xì)胞2 次（PBS 重懸細(xì)胞，600g 離心10 分鐘），加
入3 倍細(xì)胞沉淀體積的試劑一重懸細(xì)胞，反復(fù)凍融2-3 次（可在液氮中凍結(jié)，37℃水浴中溶解），
8000g 離心10 分鐘，收集上清于4℃待測(cè)，若暫時(shí)不能完成測(cè)試可放于-80℃保存（可保存10 天）。
操作步驟
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，分光光度計(jì)調(diào)節(jié)波長(zhǎng)412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、試劑二放置37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（一般物種）水浴中保溫30min。
3、空白管檢測(cè)：取超微量比色皿，依次加入20μL 蒸餾水，140μL 試劑二，40μL 試劑三，混勻，
放置2min 后測(cè)定412nm 吸光度A1。
4、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
稱1mg 標(biāo)準(zhǔn)品用1ml 蒸餾水溶解，濃度為1mg/ml。取適當(dāng)溶液配制濃度為200μg/ml、100μg/ml、
50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品（試劑一十倍稀釋后進(jìn)行稀釋）。
取1.5mlEP 管依次加入20μL 標(biāo)準(zhǔn)品，140μL 試劑二，40μL 試劑三，每管混勻后靜置2min，檢
測(cè)412nm 處吸光度，吸光度減去空白孔（A1）為橫坐標(biāo)，根據(jù)吸光度（x）和濃度（y，μg/ml）做
出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5、樣品管測(cè)定：取超微量比色皿，依次加入20μL 樣品，140μL 試劑二，40μL 試劑三，混勻后靜
置2min 檢測(cè)412nm 處吸光度A2，△A= A2- A1。
6、酶標(biāo)儀操作同分光光度計(jì)，操作盡量迅速。
GSH 含量計(jì)算
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品△A 帶入公式中（x），計(jì)算出樣品濃度y（μg/ml）。
（1）按蛋白濃度計(jì)算
GSH（μg / mg prot）=y×V 反總÷V 樣÷Cpr =y×10÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
GSH（μg /g）= y×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)= y×10 ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
GSH（μg /10 4cell）= y×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)= y×10 ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
GSH（μg / mL）= y×V 反總÷V 樣= y×10
V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣總：上清液總體積，1 mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清
液體積，20μL=0.02 mL；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。
注意事項(xiàng)：
1、樣品處理需勻漿*，若當(dāng)天不能完成測(cè)量，可放-80℃保存。
2、標(biāo)準(zhǔn)品：還原型谷胱甘肽現(xiàn)配現(xiàn)用。
3、若不確定樣品中GSH 含量的高低，可稀釋幾個(gè)梯度后再進(jìn)行測(cè)量。
4、因?yàn)樵噭┮恢泻械鞍踪|(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。

相關(guān)文獻(xiàn):

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