丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

貨號: BC0380

規格: 50T/48S

產品內容：

試劑一：液體60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體1mL×1 支，-20℃避光保存；

試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1 支，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1 支，4℃保存；

試劑七：粉劑×1 支，4℃保存；

工作液的配制：臨用前把試劑四、五、六、七轉移到試劑三中混合溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周。

產品說明：

     PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環連接起來。PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導致605nm光吸收的減少。

需自備的儀器和用品：

     可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL 比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的處理

    稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入1mL 試劑一和 10μL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

     1、分光光度計預熱 30min以上，調節波長 605nm，蒸餾水調零。

     2、每個樣本需要900μL工作液，按樣本數加一取出一定量的工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）中孵育5min。

     3、空白管：在1mL比色皿中加入900 µL工作液和50µL水，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，計算 ΔA空白=A1-A2。

     4、測定管：在1mL 比色皿中加入900 µL工作液和50µL樣本，混勻，立即記錄 605nm 處初始吸光值A3和1min后的吸光值A4，計算ΔA測定=A3-A4。

三、PDH 活性計算

    （1） 按樣本蛋白濃度計算

     單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U /mg prot）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T

=904.762×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

    （2） 按樣本鮮重計算

     單位的定義：每g組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性(U/g鮮重)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=913.81×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

     單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

     PDH 活性(U/10⁴ cell)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=1.828×(ΔA測定-ΔA空白)

     V 反總：反應體系總體積，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

注意事項：

1、測定過程中所有樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進行稀釋。 

 相關文獻：

《Engineering Corynebacterium glutamicum for high-titer biosynthesis of hyaluronic acid.》 作者:Fangyu Cheng,Huimin Yu,Gregory Stephanopoulos 期刊:Metab. Eng. 影響因子:7.808 PMID:31301358
 

丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒