promega M1701 使用說明

更新時間：2015-06-19

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說明

Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(MMLV RT，M-MLV 逆轉錄酶) 是一種RNA 依賴的DNA 聚合酶，可用于長mRNA (>5kb) 為模板的cDNA 合成。該酶是M-MLV 的pol 基因產(chǎn)物，由一個分子量為71kDa 的亞單位組成。M-MLV RT 的RNase H 活性比常用的鳥類成髓細胞性白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus，AMV) 逆轉錄酶弱。

特點

? 提供5× 反應緩沖液：250mM Tris-HCl (pH 8.3，25℃ )，375mM KCl，15mM MgCl₂，50mM DTT。

? 高溫失活：在70℃加熱M-MLV RT 10 分鐘滅活。

儲存條件

儲存于-20℃。

產(chǎn)品目錄號： M1701 M1705

M-MLV 反轉錄酶簡明操作步驟
cDNA*鏈合成操作步驟：
請使用者準備：
z 重組 RNasin?核酸酶抑制劑 (目錄號 N2511)
z dATP,10mM
z dCTP,10mM
z dGTP, 10mM
z dTTP, 10mM
z 無核酸酶的水

1．在一支無核酸酶污染的小離心管中加入： RNA 2ug 引物 1ug 無核酸酶水補齊 15ul 加熱離心管到 70℃，5 分鐘，這樣可以打開模板的二級結構。然后立即在冰上冷卻，以避免重新形成二級結構。短暫離心，使溶液歸于管底。

2. 按以下順序在復性的引物/模板管(即以上小離心管)
中加入下列組分：
注意：不要改變引物與 mRNA的比例。
M-MLV 5XReaction Buffer 5ul
dATP,10mM 1.25ul
dCTP,10mM 1.25ul
dGTP, 10mM 1.25ul
dTTP, 10mM 1.25ul
重組 RNasin?核酸酶抑制劑 25units M-MLV 反轉錄酶 200units 加無核酸酶水補齊 25ul

3. 輕彈離心管混合溶液。若使用隨機引物，在 37℃孵育 60分鐘進行反轉錄反應；若使用其它引物(Oligo (dT)或基因特異引物)，則在 42℃孵育 60分鐘進行反應。

4. 第二條鏈合成可使用您選擇的操作方法，也可參考:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.

注意：M-MLV 反轉錄酶緩存液與許多下游應用相容。在進行第二鏈合成或 PCR 之前，一般無需使用酚抽提及乙醇沉淀純化合成的*鏈 cDNA。