鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用說明

鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用說明
貨號：C8062
保存：4℃保存，切勿凍存，有效期為一年。
規格：10mg, 5mg/ml, 溶解于 0.006mol/L HAc, 無菌。
產品簡介：
索萊寶鼠尾膠原蛋白 I型(rattailtendon collagen type I)是通過 Birkedal-Hansen的方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備的。本公司鼠尾膠原蛋白可用于包被細胞培養器皿，培養一些在普通細胞培養器皿中不易貼壁的細胞。也可用于制備三維膠，模擬真實的生長環境，使細胞在三維環境中生長。
1，在使用索萊寶鼠膠原蛋白I型包被的細胞培養皿中檢查到PC-12細胞的貼壁和生長。
2，在 1mg/ml濃度以上，pH為7左右時可形成具有一定強度的三維膠，檢查到NIH-3T3細胞在三維膠內正常生長、PC-12細胞在三維膠表面正常生長。
使用方法：
1、細胞培養器皿的表面包被推薦濃度： 1-5ug/cm2
以包被濃度為 2 ug/cm2 為例：用無菌0.006mol/L(0.36g/L) 乙酸將膠原蛋白稀釋到0.012mg/ml。
按以下表格體積加到相應的培養器皿中：

按以下表格體積加到相應的培養器皿中：
                  表面積（cm2 ,每孔或每皿）        加入 0.012mg/ml 膠原的體積( ul )
96孔細胞培養板           0.3                                50
24孔細胞培養板           1.9                                300
12孔細胞培養板           3.8                                600
6孔細胞培養板            9.5                                1580
35mm細胞培養皿           8                                  1330
60mm細胞培養皿          21                                  3500
100mm細胞培養皿         55                                  9170
確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺上過ye晾干。也可以在室溫放置 1小時后，用PBS洗3-4次后直接使用。包被好的器皿在 4-25℃少可保存3個月以上的時間。
2、三維膠原的制備
鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/ml以上，pH 7左右時可形成具有一定強度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml。膠原蛋白溶解于0.006mol/L 乙酸中，在成膠過程中需要加入0.06×體積的 0.1mol/L NaOH 來中和。
需要的溶液（均需要無菌、預冷）：10×PBS（可含10 mg/L的酚紅用于 pH 指示）或 10×培養液，, 0.1mol/L NaOH，0.1mol/L 乙酸(一般不用)，雙蒸水
A． 不含細胞的三維膠原的制備（以配制1毫升，1mg/ml三維膠為例）：將200ul鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中，加入 690ul H2O。然后加到12ul 0.1mol/L NaOH中（如果反過來把12ul 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結），立即混勻。再加入100ul 10×PBS
或10×培養液，混勻后立即加到培養器皿中(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試)。將培養器皿在室溫(25度左右)下放置20分鐘待膠凝固后，轉移到培養箱內。如果配制中使用的是10×PBS，使用前需要加入適當體積的細胞培養液預平衡。
B．含細胞的三維膠原的制備（以配制1毫升，1mg/ml三維膠為例）：準備好懸浮于培養液的細胞，并放置于冰浴中。將200ul鼠尾膠原蛋白I型 (5mg/ml)加到12ul 0.1mol/L NaOH中（如果反過來把12ul 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結），立即混勻。再加入23ul 10×PBS或10×培養液，混勻(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試)。加入760ul的細胞懸浮液，混勻后立即加到培養器皿中。將培養器皿在室溫下放置20分鐘待膠凝固后，加入適當體積的細胞培養液，轉移到培養箱中培養。
注意事項：
鼠尾膠原蛋白I型在室溫下pH中性時可迅速成膠，在操作過程中要盡量保持低溫。