封閉液中的蛋白可以與固相載體表面的空白位置結合，同樣以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上，因為有“填補”和覆蓋“蛋白結合位點以避免一抗的非特異性結合，所以有”封閉“的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠狠牢固的結合在空白位置上，這樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結合。
1.血清：封閉血清的原理主要有兩點，第一是待測樣本有些與蛋白非特異性結合的物質，從而導致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分分特異性的結合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區別。第二待測樣品中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區結合，與抗體特異性無關，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結合，BSA無法封閉Fc受體。
2.脫脂奶粉：脫脂奶粉最大的優點是價格便宜，但由于成分相對復雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會導致背景增加，此外，因為自身含有生物素，不能用于生物素標記的抗體系統。脫脂奶粉種含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留，在使用生物素-親和素系統和堿性磷酸酶標記的二抗時，也會使得高背景或本底水平增高。
3.BSA：BSA是常用的封閉液，成分單一適用于大多數情況。若免疫原是偶聯BSA的，BSA有很強的免疫原性，會導致產生很多針對BSA的抗體，為避免交叉反應，不能用BSA，脫脂奶粉封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉液。
