藍白斑篩選及其原理介紹

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法： 是根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。

由α-互補產生的Lac+ 細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到載體的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去α-互補能力, 因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。 在麥康凱培養基上，α-互補產生的Lac+細菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養基中的乳糖，產生乳酸，使pH下降，因而產生紅色菌落，而當外源片段插入后，失去α-互補能力，因而不產生β-半乳糖苷酶，無法分解培養基中的乳糖，菌落呈白色。

藍白斑篩選的分子生物學基礎是建立在乳糖操縱子正負調控機制上的：

 1、乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個結構基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉移酶，此外還有一個操縱序列O，一個啟動子P和一個調節基因I。2、阻遏蛋白的負性調節：沒有乳糖存在時，基因編碼的阻遏蛋白結合于操縱序列O處，乳糖操縱子處于阻遏狀態，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時，乳糖作為誘導物誘導阻遏蛋白變構，不能結合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導開放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調控機制為可誘導的負調控。3、CAP的正性調節：在啟動子上游有CAP結合位點，當大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環境轉變為以乳糖為碳源的環境時，cAMP濃度升高，與CAP結合，使CAP發生變構，CAP結合于乳糖操縱子啟動序列附近的CAP結合位點，激活RNA聚合酶活性，促進結構基因轉錄，調節蛋白結合于操縱子后促進結構基因的轉錄，對乳糖操縱子實行正調控，加速合成分解乳糖的三種酶。4、協調調節：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負調控與CAP的正調控兩種機制，互相協調、互相制約。
 
可以采用X-Gal而不是X-a-Gal進行Matchmaker System藍白斑篩選嗎？

不可以，X-Gal與X-a-Gal不同。X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶（lacZ）的反應底物，而X-a-Gal是酵母α-半乳糖苷酶（Mel 1p）的反應底物。X-a-Gal在Matchmaker Gold系統中用作藍白篩選的篩選標記，在蛋白互作激活MEL1基因表達后，酵母細胞可以分泌表達Mel 1p。