蛋白電泳 SDS-PAGE原理

SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質分子結合成復合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質-SDS 復合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。實驗使用過程中，還加入DTT或者巰基乙醇，以打開蛋白間的二硫鍵，破壞蛋白質的四級結構。SDS—PAGE常采用垂直板不連續系統（分離膠與濃縮膠）。

一、樣品制備

本公司有多種用于樣品制備的組織裂解液，每款裂解液會配備一管蛋白酶抑制劑pmsf。本公司還有多種蛋白酶抑制劑供您使用。

• 實驗試劑
• 蛋白提取
• 蛋白定量

注：本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合于Bradford蛋白濃度測定試劑盒，請選擇BCA法或者Lowry法。

蛋白含量測定是以標準蛋白作為對照，根據蛋白濃度不同，吸光值不同而達到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光譜吸收法）來定量，但更多的是用染料對蛋白進行染色，利用染料與蛋白結合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來定量的。后一種方法應用更普遍。蛋白定量方法的選擇，應該考慮到蛋白結構（標準品選擇）、蛋白溶液內干擾物等因素的影響。

二、蛋白電泳

• 實驗試劑
• 預制膠
• 制膠
• 上樣及電泳
• 染色

SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，實驗室可根據自己的情況和習慣來選擇試劑。如選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9全部試劑可自己配制。也可以選擇配制好的試劑。如10、11、12、13/14、16、9、20。還可選擇10、13/14、16、9、17、18、19、20。

凝膠配制表（一）

凝膠配制表（二）

本公司的丙烯酰胺是29：1的，如需要定制其他規格的可以。 為了客戶實驗方便，我們生產的SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（P1200）和Tris- Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（P1320），后者主要用于小于10kd的蛋白和多肽的分離。包含了制膠的全部試劑，方便客戶操作。 如果您想節省時間，也可以使用我們的預制膠，無需配膠，直接跑電泳即可。本公司的上樣緩沖液既有用于非變性的（P1017、p1027）又有變性的（P1015、P1016、P1017、P1018），有不同的稀釋倍數，可以滿足客戶的多種實驗需求。 電泳緩沖液既有用于普通的tris-甘氨酸緩沖系統的產品（T1070），又有用于Bis-tris這種系統的MOPS緩沖液（T1510） 蛋白marker有多種，非預染marker、預染marker、彩虹marker、Western Blot Marker。而且還有GE原裝的變性非變性marker，廣泛的分子量和用途供您選擇。

跑膠后的染色可以用銀染或者考染的方法，如果蛋白量少，推薦使用靈敏度高一些的銀染試劑盒（G7210），否則常規染色可以使用（P1305）和（P1300），其中P1300的優點是染色時間短，半小時內即可檢測到蛋白電泳條帶，節省了染色脫色的時間。

三、Western blot

經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分，此技術稱為免疫印跡（Western blot）。Western blotting檢測系統除需要過氧化物酶標記的各種二抗外，還需要配套的顯色試劑。索萊寶提供DAB顯色和ECL化學發光兩種試劑及相應試劑盒。

• 轉膜
• 顯色

和PALL公司的尼龍膜和pvdf膜，具有0.22um和0.45um兩種規格。 轉膜后還可以用P0012（10×麗春紅）檢測轉膜效果，尤其是針對NC膜效果更佳。 為了節省成本和時間，您可以選擇本公司的SW3020（Western Blot膜再生液）對用過的膜進行清洗，隨后，可以使用不同的抗體進行下一輪Western Blot實驗。 膜再生液實質是在不影響膜上結合的抗原的條件下將抗體洗脫下來，實際操作中，膜類型、抗體類型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。 注意：適用于 ECL和類似的化學發光試劑進行的 Western 檢測。不適用于非化學發光試劑進行的 Western檢測，例如DAB，NBT/BCIP。

實驗操作過程中您可以針對不同的抗體選擇上面合適的稀釋液。